P, 5.02.2023

Erilised nanokehad aitavad arendada väheste kõrvaltoimetega ravimeid

Ajakirjas Horisont ilmunud suur lugu
, molekulaarbioloog
Erilised nanokehad aitavad arendada väheste kõrvaltoimetega ravimeid
Facebook Messenger LinkedIn Twitter
Comments
Krüo-elektronmikroskoopia teel saadud ruumiline kujutis koroonaviiruse ogavalgust (sinine) koos sellega seostunud nanokehadega (roosa). Nanokehad blokeerivad ogavalgul inimese rakkudega seostumiseks olulise piirkonna ja neutraliseerivad seega viirusosakese
Krüo-elektronmikroskoopia teel saadud ruumiline kujutis koroonaviiruse ogavalgust (sinine) koos sellega seostunud nanokehadega (roosa). Nanokehad blokeerivad ogavalgul inimese rakkudega seostumiseks olulise piirkonna ja neutraliseerivad seega viirusosakese Foto: PROTEIN DATA BANK / 7KSG

Bioloogia- ja meditsiinivaldkonna teadustöös püütakse leida ja arendada selliseid aineid, mis suudaksid väga spetsiifiliselt seostuda soovitud sihtmärgiga. Need on ained, mis liituvad tugevalt kindla paarilisega, ja liituvad nõrgalt või ei seostu üldse teiste rakus või organismis leiduvate ainetega. Meditsiinis aitavad niisugused erilised molekulid arendada võimalikult väheste kõrvaltoimetega ravimeid, aga molekulaarbioloogias väga täpselt uurida nii teatud valke kui ka rakke.

Ühed looduslikud väga eriomase seostumisvõimega valgud on antikehad. Näiteks inimese organism toodab juhuslikkuse alusel kuni 10 miljardit immuunrakku, millest igaüks on võimeline selle pinnal oleva antikeha abil ära tundma mitmesuguseid mikroskoopilisi võõrkehasid, nagu viiruse või bakteri pinnavalk või mõni muu eksikombel vereringesse sattunud osake. Kõiki neid immuunrakke ei ole loomulikult vaja, kuid igaks juhuks on nad siiski olemas. Kui võõrkeha satub organismi ja seal leidub immuunrakk, mis just selle molekulaarse kuju ära tunneb, siis rakk aktiveerub. Selle antikehasid asutakse paljundama ning organism surub sissetungija rünnaku maha. Seejuures tekivad ka sama antikeha kandvad mälurakud, mis võimaldavad järgmisel kokkupuutel sama osakesega tekitada juba palju kiirema ja tõhusama antikehavastuse.

Immuunsüsteemi oskus valida välja ja paljundada võõrkehaga tugevalt seostuvaid antikehasid annab biotehnoloogias võimaluse saada eriomaseid seostumispartnereid.

Kuigi saab toota selgroogsete IgG-tüüpi antikehasid, mis seostuvad kõikvõimalike sihtmärkidega, leidub neil ehituse tõttu hulk puudusi. IgG-tüüpi antikeha on suur molekul, mis koosneb neljast valguahelast: kahest raskest ja kahest kergest ahelast, mille molaarmass on kokku umbes 150 000 g/mol. Ent selliseid liitvalke on raske toota, kuna ei bakteri ega päristuumse raku sees ei ole soodne keskkond valguahelaid ühendavate ja nende kuju stabiliseerivate väävelsildade tekkeks. Samal ajal moodustub IgG-tüüpi antikeha pind, mis tunneb ära võõrkeha, just kahe valguahela kokkusobitumisel, niisiis on see kriitilise tähtsusega, et antikeha saaks toimida. Pealegi on kahest valguahelast koosnev äratundmispind suhteliselt suur, seega võivad näiteks võõra valgu pinnal olevad väiksemad lohud ja õnarused jääda IgG-antikehadele nähtamatuks.

Nanokehade avastamine

1989. aastal lasi Brüsseli vaba ülikool­i (VUB) professor Raymond Hamers üliõpilastel praktilise tööna katsetada antikehade välja puhastamist kaameli verest. Veri oli laboris mõeldud hoopis teiste uuringute tarbeks, kuid seda oli piisavalt, et uus ülesanne pakuks üliõpilastele rutiinses praktikumitöös vaheldust. Üllatuslikult leidsid nad, et kaameli veres leidub peale tavapäraste antikehade senitundmatuid veidi väiksemaid valke, mille molaarmass on umbes 100 000 g/mol. Loomulikult kahtlustasid nad alguses, et tegu on IgG-antikehade tükkidega, näiteks lagu- produktidega, või hoopis katseveaga. Kuid edasised uuringud kinnitasid, et mitte ainult üksküürkaameli, vaid ka teiste kaamellaste veri sisaldabki erilisi antikehasid. Nende eripära on kergete ahelate puudumine, mis tähendab, et võõrkeha ära tundev antikeha pind moodustub ühestainsast valguahelast. Ühtlasi võimaldab niisugune antikehade omapära toota neist laboris ainult võõrkehi ära tundvaid väikesi osasid ehk nanokehasid.

IgG-tüüpi antikeha, kaameli antikeha ja nanokeha võrdlus. Tumedama tooniga on tähistatud rasked, heledamaga aga kerged valguahelad. Looduslike antikehade vasak ja parem pool on sümmeetrilised, kumbki saab iseseisvalt sihtmärgiga seostuda
IgG-tüüpi antikeha, kaameli antikeha ja nanokeha võrdlus. Tumedama tooniga on tähistatud rasked, heledamaga aga kerged valguahelad. Looduslike antikehade vasak ja parem pool on sümmeetrilised, kumbki saab iseseisvalt sihtmärgiga seostuda Foto: Horisont

Nanokehade eelised

Selliste nanokehade kasutamine aitab suuremal või vähemal määral vältida kõiki eespool kirjeldatud IgG-antikehadega seotud probleeme. Et moodustuks nanokeha aktiivne äratundmispind, ei ole vaja liita mitut valguahelat väävelsildade abil, seega saab nanokehasid kergesti sünteesida nii bakteris kui ka päristuumses rakus.

Mitmeti on kasulik ka nanokehade väiksus, nende molaarmass on umbkaudu 15 000 g/mol, s.o kümme korda väiksem kui IgG-antikehade oma. Üldjuhul on biotehnoloogias lihtsam toota väiksemat valku. Peale selle mahuvad nanokehad tänu väikestele mõõtmetele ka sihtmärkmolekuli pinnaõnarustesse, kuhu IgG-antikehad oma suuruse tõttu ligi ei pääse. Piltlikult öeldes saab nanokehade abil märklaua pinda skaneerida parema lahutusvõimega, seepärast on tõenäosus leida uuritava valgu või molekuliga tugevalt seostuv variant suurem.

Nanokehade tootmine

On mitu moodust toota meid huvitava molekuli vastu nanokehi. Mõnel juhul saab molekuli süstida otse looma organismi. Selleks otstarbeks kasutatakse kodustatud kaamellasi: üks- ja kaksküürkaameleid, laamasid ja alpakasid. Süstimine ei ole loomale ohtlik. Tema organism asub kehasse viidud molekuli vastu antikehasid tootma. Kui on süstitud mitu doosi, saab mõne aja pärast teha tema vereproovist kindlaks kõigile toodetavatele antikehadele vastavad DNA-järjestused ja neid paljundada. Neist sõelutakse välja ainult nanokehi kodeerivad DNA-lõigud ning edasisel valikul saabki tuvastada just uuritava molekuliga seostuvad variandid. Sedalaadi meetodi eelis on asjaolu, et kui loomasse süstida sama molekuli mitu korda, siis immuunvastus küpseb ning saab välja valida kõige tõhusamalt seostuvad antikehad.

Alpaka on kodustatud kaamellastest üks loom, kelle abil on võimalik mitmesuguste valkudega hästi seostuvaid nanokehi toota
Alpaka on kodustatud kaamellastest üks loom, kelle abil on võimalik mitmesuguste valkudega hästi seostuvaid nanokehi toota Foto: NOTNOISY / WIKIPEDIA

Alati ei ole otstarbekas ega võimalikki süstida eluslooma. Näiteks ei saa süstida aineid, mis on loomale või keskkonnale mürgised. Pealegi ei kutsu mitmed molekulid, näiteks DNA ja RNA, esile väga tugevat immuunvastust (oluline on eristada, et mRNA-vaktsiinides ei teki immuunvastus mitte RNA enda, vaid RNA juhiste järgi sünteesitud valkude vastu).

Alternatiivina saab luua looduslikke või sünteetilisi nanokehade genoteeke: segusid väga paljudest nanokehi kodeerivatest DNA-lõikudest. Nende lõikude põhjal toodab bakterikultuur ühes segus hulganisti erisuguseid nanokehi. Seejärel hinnatakse sihtmärgiga seostumist mitmes valikuringis ja lõpuks leitakse sobiv variant. Selleks et luua looduslik genoteek, läheb vaja suurt kogust mitme kaameli verd, et paljundada sellest piisav kogus nanokehasid kodeerivaid geene.

Sünteetilise genoteegi saamiseks ei ole looma ennast üldse tarvis. Aluseks võetakse nanokeha kodeeriv geen ning selle sihtmärgiga seostuva ala piirkonda viiakse sisse juhuslikke mutatsioone. Mõlema meetodi eelis on lihtsus ja universaalsus: kord juba loodud genoteek võimaldab korduvalt otsida eri sihtmärkide vastu töötavaid nanokehi. Samas ei saa genoteekidest leitud nanokehavariandid läbida looduslikku immuunküpsemise protsessi. Seetõttu kasutatakse sobivate sihtmärkide, näiteks mittetoksiliste valkude puhul võimaluse korral siiski looma immuniseerimist.

Nanokehade tarvitus meditsiinis

Antikehasid kasutatakse ravimitena peamiselt mitut tüüpi kasvajate ja autoimmuunhaiguste vastu, aga ka mõnede viirusnakkuste korral. Eu-roopa ravimiamet kiitis 2021. aasta novembris heaks kaks suurtel antikehade doosidel põhinevat koroonaviirushaiguse vastast ravimit, mida on plaanis hankida ka Eestil. Need põhinevad siiski IgG-tüüpi antikehadel, seega on neid keeruline ja kallis toota.

IgG-antikehade asemel saaks neis samu ülesandeid edukalt täita nanokehad, mis pole inimesele mürgised ega muul moel ohtlikud. Pealegi on üksik nanokeha piisavalt väike, et neerude kaudu kiiresti organismist väljuda. See asjaolu annab võimaluse kujundada nanokehateraapiat vajadust mööda: nii, et nanokeha püsiks organismis lühemat või pikemat aega. Pikema toimeaja saavutamiseks on võimalik konstrueerida suuremaid liitvalke, mida neerud ei väljuta. Näiteks võib üheks molekuliks liita mitu koopiat samast nanokehast või hoopis siduda nanokeha mõne suurema kandjavalguga.

2018. aastal kiideti Euroopas heaks esimese ravinanokeha tarvitus haruldase haiguse aTTP vastu: selle tõve vältel tekivad mikrotrombid. Eestiski müügiloa saanud preparaadis Cablivi sisalduvad nanokehad seostuvad verehüübimises osaleva valgu, nn von Willebrandi faktoriga ega lase selle valgu molekulidel üksteisega seostuda. Selle ravimi arendamisel eelistati IgG-tüüpi antikehadele just nanokehasid. Kuna IgG-molekulil on kaks ühesugust äratundmispiirkonda, saaks see omavahel siduda kaks von Willebrandi faktorit. Seetõttu kardeti, et IgG-antike- had võiks seeläbi hoopis soodustada von Willebrandi faktorite aktiveerumist. Praegu on aTTP-vastane Cablivi ainus nanokehal põhinev ravim turul.

Kliinilistes uuringutes katsetatakse veel mitut ravinanokeha, millest loodetakse abi eri tüüpi kasvajate, aga ka autoimmuunhaiguste, nagu psoriaasi ja reumatoidartriidi vastu. Juba pandeemia alguses hakati katsetama ka SARS-CoV-2 ogavalgu neutraliseerimist nanokehadega. On leitud kümneid ogavalguga seostuvaid nanokehasid, millest mõnel on hamstrite näitel võime nakatumist ära hoida. Inimkatseteni on jõudnud näiteks nanokeha XVR011, mis seostub ogavalgul eri tüvedes suhteliselt muutumatuna püsiva piirkonnaga ning takistab koroonaviirusel seostuda inimese rakkudega. Esimese ja teise faasi katsete tulemusi oodatakse tänavuse aasta suveks.

Kuna üksiku nanokeha kiire eritumine organismist on seotud nanokeha suure sihtmärgispetsiifilisusega, võib eeldada, et nanokehadega saab organismis kindlasse kohta või kindlat tüüpi rakkudeni kanda ka muid aineid. Kasvajate ravis kasutatakse otse organismi viidavaid lühikese poolestusajaga radioaktiivseid aineid, näiteks aktiinium-225 või luteetsium-177. Radioaktiivse aatomi saab liita üksiku nanokeha külge, mis määrab kindlaks kasvajavalgu ning seob kiirgusallika täpselt sihtmärgiga. Samal ajal lahkub seostumata nanokeha koos kiirgusallikaga organismist, nõnda saavad teised koed vähem kahju. Kui nanokeha on liidetud mõne kompuutertomograafias kasutatava märgisega, saab sama põhimõtte järgi hinnata kasvajate levikut. Kuna sedalaadi preparaat seostub sihtmärgiga ja eritub vaba nanokeha, saavutatakse üsna kiiresti pärast manustamist olukord, kus kasvaja on tõhusalt märgistatud, aga muud koed mitte. Samamoodi saab organismis jälgida ka põletikuprotsesse või teisi haigusseisundeid, mida iseloomustab kindlate valkude esinemine.

Kokku võttes: nanokehasid kui väiksemaid, odavamaid ja stabiilsemaid analooge saab kasutada enamikus rollides, mida praegu etendavad suured IgG-tüüpi antikehad. Sünteetiliste nanokehagenoteekide loomine on suure takistusena kõrvaldanud vajaduse kasvatada iga eksperimendi tarbeks kaameleid või laamasid, mistõttu võib loota, et lähemas tulevikus kuuleme neist kui efektiivsetest terapeutilistest ja teaduslikest vahenditest üha tihedamini.

Kasutamine teadusuuringutes

Nanokehad on avanud uusi võimalusi struktuuribioloogias, kus määratakse kindlaks valkude ruumilist kuju. Põhimeetodina rakendatakse kristalliseeritud valkude röntgendifraktsioonanalüüsi. Selle tehnoloogia suurim kitsaskoht on uuritavast valgust kvaliteetsete kristallide saamine. Eriti raske on saada kristalle valkudest, mis sisaldavad paindlikke ilma kindla struktuurita piirkondi.

Kristallis on valgumolekulid paigutunud korrapäraselt; selleks peab neil olema ühesugune ruumiline kuju. Kui sama valgu eri molekulides asetseb paindlik osa eri moodi, takistab see korrapärase kristalli moodustumist. Siin saavadki aidata nanokehad, mis seostuvad valgu paindliku osaga ja lukustavad selle ühte kindlasse asendisse. Sel viisil saadud jäigemat valku on võimalik suurema tõenäosusega edukalt kristalliseerida. Loomulikult on oht, et nanokeha seostumisel saadud valgustruktuur on tehislik, bioloogilise mõtteta. Seda ohtu on siiski võimalik hinnata, näiteks saab julgemaid järeldusi teha nanokeha seostumispaigast kaugemale jäävate valgupiirkondade kohta.

Üha enam kasutatakse valgustruktuuride määramiseks ka krüoelektronmikroskoopiat, mille korral valgulahus külmutatakse õhukesse jääkihti ning sellest tehakse ülimadalal temperatuuril elektronmikrofotod. Saadud fotodelt tuleb muu müra hulgast teha kindlaks tuhandeid uuritava valgu molekule ning neid tarkvara abil kombineerides ongi võimalik rekonstrueerida kogu valgu ruumiline kuju.

Võrreldes kristalliseerimisega on niisuguse tehnoloogia eelis asjaolu, et selleks on vaja ainult suhteliselt väikese kontsentratsiooniga valgulahust. Meetodi puudus on tõik, et mürarikastelt fotodelt on raske õigeid valgumolekule välja valida: seda keerukam, mida väiksemad on uuritavad valgud. Kuigi valgu suuruse alampiir nihkub järjest allapoole, on siiski mugavam töötada suuremate valkudega. Siin saavad kasulikud olla nanokehade alusel loodud liitvalgud, kus on võimalikult jäigalt ühendatud mitu uuritava valguga seotud nanokeha. Nii saab kaks uuritavat valgumolekuli ühendada nanokehadest silla abil, sellist moodustist on elektronmikrofotodelt tunduvalt kergem tuvastada. Ka mikroskoopia abil on otsitavaid struktuure lihtsam leida, kui valgumolekulid ei ole liiga paindlikud ning neid saab liita sobivalt seostuvate nanokehade abil

Andres Ainelo (1989) on molekulaarbioloog. 2018. aastal Tartu ülikoolis kaitstud doktoritöös uurinud kasvukiirust vähendava toksiini GraT mõju bakterile. Praegu töötab järeldoktorantuuri raames Brüsseli vabas ülikoolis (ULB), uurides laamadelt pärit antikehade abil bakterite keskse stressitaluvusvalgu olemust.

Foto: Horisont / MTÜ Loodusajakiri

Artikkel ilmus ajakirja Horisont märtsi-aprilli numbris.

Märksõnad
Tagasi üles